單細胞RNA測序（scRNA-seq）作為一種高通量測序技術，它允許研究者在單個細胞水平上測量基因表達，揭示細胞群體內部的異質性，識別不同細胞類型或狀態(tài)的基因表達模式，為細胞生物學、發(fā)育生物學、疾病研究和藥物發(fā)現(xiàn)等領域的研究提供了新的維度和深度。

單細胞RNA測序技術起始于單細胞分離，Bio-Techne單細胞柔性系統(tǒng)Pala為單細胞分選提供了快速便捷的途徑。以下實驗通過單細胞柔性分選系統(tǒng)Pala分選經細胞活性染料及特異性熒光抗體標記的單個活化B細胞。通過對靜息及活化B細胞基因表達分析研究活化對基因表達的影響。

實驗步驟

（1）利用mCD40L-3T3飼養(yǎng)細胞對人原代記憶B細胞活化6天。收集活化后細胞并用抗人CD27-PE抗體及細胞活性染料CellTrackerGreen進行染色。

（2）在板中加入每孔4微升裂解液，利用單細胞柔性分選系統(tǒng)Pala將PE及FITC陽性細胞分選至96孔PCR板中。細胞裂解后進行cDNA合成及RNA建庫測序。

（3）每孔中進行VH及VL抗體可變區(qū)基因特異性擴增（qPCR）。

（4）基因文庫利用Illumina Nextseq進行測序，比較活化及靜息狀態(tài)下B細胞的基因表達差異。

實驗結果

（1）單細胞分離效率：經過擴增后，96孔中有93孔含有cDNA（97%）。

（2）單細胞驗證：Sanger測序表明所有的孔中都是單個細胞，不存在二聚體的情況。

（3）免疫球蛋白基因表達：免疫球蛋白qPCR結果顯示所有所有樣品中均表達重鏈IGVH，輕鏈僅表達kappa或lambda（IGVK、IGVL）中的一種。